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第1章 绪论1

1.1 历史背景1

1.2 组织培养的优点7

1.2.1 环境控制7

1.2.2 样品的特征和均一性8

1.2.3 经济、规模和机械化8

1.2.4 体内环境的体外模拟8

1.3 局限性9

1.3.1 专业技能9

1.3.2 量的问题9

1.3.3 去分化和选择10

1.3.4 细胞的起源10

1.3.5 不稳定性10

1.4 体外的主要差异10

1.5 组织培养的类型11

第2章 培养细胞的生物学14

2.1 培养细胞的环境14

2.2 细胞黏附14

2.2.1 细胞黏附分子15

2.2.2 细胞间连接16

2.2.3 细胞外基质16

2.2.4 细胞骨架18

2.2.5 细胞迁移18

2.3 细胞增殖18

2.3.1 细胞周期18

2.3.2 细胞增殖的调控19

2.4 细胞分化20

2.4.1 细胞分化的维持21

2.4.2 细胞去分化21

2.5 细胞信号传递24

2.6 能量代谢25

2.7 培养细胞的起源26

2.7.1 培养的开始26

2.7.2 细胞系的演化27

2.7.3 细胞的衰老28

2.7.4 连续细胞系的转化与形成28

第3章 实验室设计、布局及设备30

3.1 布局、规划和服务设施30

3.1.1 要求32

3.1.2 服务设施34

3.1.3 通风装置35

3.2 布局35

3.2.1 无菌操作区36

3.2.2 层流原理36

3.2.3 工作台36

3.2.4 检疫室和防范室36

3.2.5 培养37

3.2.6 准备区40

3.2.7 储存41

第4章 设备及材料44

4.1 组织培养实验室的要求44

4.2 无菌区46

4.2.1 洁净台46

4.2.2 手推车48

4.2.3 无菌液操作——移液和分装49

4.2.4 倒置显微镜53

4.2.5 CCD摄像机和监视器54

4.2.6 解剖显微镜54

4.2.7 离心机54

4.2.8 细胞计数55

4.3 细胞孵育和培养55

4.3.1 恒温箱55

4.3.2 湿式CO2培养箱56

4.3.3 温度记录仪57

4.3.4 滚动架57

4.3.5 磁力搅拌器58

4.3.6 培养器皿58

4.4 实验准备和杀菌58

4.4.1 清洗58

4.4.2 培养基和试剂的制备59

4.4.3 杀菌61

4.5 储存63

4.5.1 消耗品63

4.5.2 冰箱和冷冻箱63

4.5.3 冷藏器64

4.5.4 可控速率冷冻箱64

4.6 附属设备64

4.6.1 计算机和网络64

4.6.2 普通正置显微镜65

4.6.3 低温冷冻箱65

4.6.4 共聚焦显微镜65

4.6.5 PCR循环仪65

4.7 专用设备66

4.7.1 显微注射装置66

4.7.2 集落计数器66

4.7.3 可离心淘洗机66

4.7.4 流式细胞仪66

第5章 无菌技术67

5.1 无菌技术的目标67

5.1.1 微生物污染的风险67

5.1.2 无菌的维持67

5.2 创造无菌环境的各种因素68

5.2.1 层流69

5.2.2 安静的工作区域71

5.2.3 工作面71

5.2.4 个人卫生73

5.2.5 试剂和培养基73

5.2.6 培养物73

5.3 灭菌操作73

5.3.1 擦拭73

5.3.2 加盖74

5.3.3 灼烧74

5.3.4 试剂瓶和培养瓶的操作74

5.3.5 移液75

5.3.6 液体倾倒75

5.4 标准操作程序76

5.5 仪器和设备82

5.5.1 培养箱82

5.5.2 盒装培养物82

5.5.3 充入CO2气体82

第6章 安全性、生物伦理及验证83

6.1 实验室安全83

6.2 危险性评估83

6.3 标准操作程序85

6.4 安全规则85

6.5 常规安全86

6.5.1 操作者87

6.5.2 设备87

6.5.3 玻璃器皿和锐利物品87

6.5.4 化学毒性88

6.5.5 气体89

6.5.6 液氮89

6.5.7 灼烧90

6.6 火90

6.7 放射性91

6.7.1 摄入91

6.7.2 放射性废弃物的处理91

6.7.3 标记的试剂91

6.7.4 高能源91

6.8 生物危害性92

6.8.1 生物防范水平92

6.8.2 微生物学安全通风橱（MSC）94

6.8.3 人体活检材料96

6.8.4 遗传操作97

6.8.5 生物危害性废弃物处理97

6.8.6 熏蒸97

6.9 生物伦理98

6.9.1 动物组织98

6.9.2 人体组织材料98

6.10 质量保证99

6.10.1 操作程序100

6.10.2 质量控制（QC）100

6.11 验证100

6.11.1 鉴定100

6.11.2 来源101

6.11.3 污染101

第7章 培养器皿和附着物102

7.1 附着物102

7.1.1 细胞的附着和生长102

7.1.2 常见的附着材料102

7.1.3 其他替代性附着物103

7.2 表面处理103

7.2.1 基质覆盖103

7.2.2 饲养层105

7.2.3 非黏附性附着面106

7.3 培养器皿的选择107

7.3.1 细胞产量107

7.3.2 悬浮培养109

7.3.3 通风110

7.3.4 取样和分析111

7.3.5 不均匀生长112

7.3.6 价格112

7.4 特殊系统112

7.4.1 渗透性支持物112

7.4.2 三维基质113

第8章 成分明确培养基及补充物115

8.1 培养基的发展史115

8.2 物理化学特征115

8.2.1 pH115

8.2.2 CO2和碳酸盐116

8.2.3 缓冲作用123

8.2.4 氧气123

8.2.5 渗透压124

8.2.6 温度124

8.2.7 黏滞度125

8.2.8 表面张力和成泡性125

8.3 平衡盐溶液126

8.4 完全培养基126

8.4.1 氨基酸127

8.4.2 维生素127

8.4.3 盐类127

8.4.4 葡萄糖128

8.4.5 有机补充物128

8.4.6 激素和生长因子128

8.4.7 抗生素128

8.5 血清129

8.5.1 蛋白质130

8.5.2 生长因子131

8.5.3 激素131

8.5.4 营养物及代谢物132

8.5.5 脂类132

8.5.6 矿物质132

8.5.7 抑制物132

8.6 培养基和血清的选择132

8.6.1 批次预约134

8.6.2 血清的测试135

8.6.3 热灭活135

8.7 其他添加物136

8.7.1 氨基酸水解物136

8.7.2 胚胎浸出液136

8.7.3 适应性培养基136

第9章 无血清培养基137

9.1 血清的缺点145

9.2 无血清培养基的优点146

9.2.1 标准培养基的定义146

9.2.2 选择性培养基146

9.2.3 调节细胞增殖与分化146

9.3 无血清培养基的缺点146

9.4 血清的替代147

9.4.1 无血清培养基的商业供应147

9.4.2 血清替代物147

9.4.3 无血清传代培养148

9.4.4 激素149

9.4.5 生长因子149

9.4.6 血清中的营养物质154

9.4.7 蛋白质和多聚胺154

9.4.8 黏滞度154

9.5 无血清培养基的选择154

9.5.1 细胞或产物特异性154

9.5.2 适应无血清培养基157

9.6 无血清培养基的研发157

9.7 无血清培养基的制备157

9.8 无动物蛋白培养基158

9.9 小结158

第10章 准备与灭菌159

10.1 准备试剂与用品159

10.2 设备与液体的灭菌159

10.3 设备162

10.3.1 玻璃器皿162

10.3.2 玻璃移液管165

10.3.3 螺口盖168

10.3.4 清洁剂的选择170

10.3.5 种类繁杂的设备170

10.3.6 可重复使用的灭菌过滤器171

10.4 试剂与培养基173

10.4.1 水173

10.4.2 纯水器的维护175

10.4.3 平衡盐溶液175

10.4.4 培养基的配制与灭菌177

10.4.5 干粉培养基180

10.4.6 特制培养基182

10.5 培养基的灭菌183

10.5.1 可高压灭菌的培养基183

10.5.2 除菌过滤183

10.5.3 血清192

10.5.4 其他试剂的准备与灭菌195

10.6 培养基的质控、检测和储存196

10.6.1 质量控制196

10.6.2 无菌检测196

10.6.3 培养物检测197

10.6.4 储存197

第11章 原代培养199

11.1 原代培养入门199

11.1.1 用于解离组织的酶199

11.1.2 解离过程的共同特点200

11.2 组织分离200

11.2.1 小鼠胚胎200

11.2.2 鸡胚204

11.2.3 人体活检材料206

11.3 原代培养的类型207

11.3.1 原代外植207

11.3.2 酶的解离作用210

11.3.3 温胰蛋白酶消化210

11.3.4 低温预处理的胰蛋白酶消化213

11.3.5 鸡胚器官原基216

11.3.6 其他酶解过程219

11.3.7 胶原酶220

11.3.8 机械法解离222

11.3.9 分离活细胞224

11.3.10 原代培养小结225

11.3.11 原始记录225

第12章 传代培养和细胞系227

12.1 传代培养和扩增227

12.1.1 交叉污染和鉴定错误229

12.1.2 支原体污染231

12.1.3 术语定义231

12.1.4 细胞系的命名232

12.1.5 培养物的年龄233

12.2 选择细胞系233

12.3 常规培养234

12.3.1 细胞形态的意义234

12.3.2 培养基的更换235

12.3.3 标准的换液方案236

12.4 传代238

12.4.1 传代标准240

12.4.2 单层生长细胞典型的传代方案241

12.4.3 生长周期和传代比率243

12.4.4 传代时的细胞浓度245

12.4.5 悬浮培养细胞的扩增245

12.4.6 悬浮生长细胞的传代246

12.4.7 培养条件的标准化248

12.4.8 抗生素的使用248

12.4.9 培养记录249

第13章 克隆培养及筛选251

13.1 克隆培养251

13.2 贴壁率的刺激255

13.2.1 促进克隆生长的条件255

13.2.2 条件培养基256

13.2.3 饲养层细胞257

13.3 悬浮克隆培养259

13.4 细胞克隆的分离264

13.4.1 单层贴壁细胞克隆的其他分离技术267

13.4.2 悬浮细胞克隆268

13.5 复制性培养269

13.6 选择性抑制剂269

13.7 遗传变异细胞的筛选270

13.8 细胞与基质的相互作用272

13.8.1 选择性黏附272

13.8.2 选择性脱壁272

13.8.3 基质性质273

13.8.4 选择性饲养层273

13.8.5 半固体培养基选择273

第14章 细胞分离275

14.1 细胞密度及等密度沉降法275

14.2 细胞体积与沉降速率279

14.2.1 单位重力沉降279

14.2.2 离心淘洗分离技术279

14.3 以抗体为基础的分离技术280

14.3.1 免疫盘化法281

14.3.2 免疫磁珠分选281

14.4 荧光活化的细胞分选法284

14.5 其他分离技术285

14.6 初学者如何进行细胞分离实践286

第15章 细胞鉴定287

15.1 鉴定的需求287

15.2 真实性验证287

15.3 保存记录和身世288

15.4 鉴定指标288

15.4.1 种属鉴定289

15.4.2 谱系或组织标记289

15.4.3 独特标记物291

15.4.4 转化291

15.5 细胞形态学291

15.5.1 显微镜使用295

15.5.2 染色297

15.5.3 细胞学检查所用培养器皿：单层培养299

15.5.4 悬浮细胞细胞学检查标本的制备299

15.5.5 光学显微照相技术302

15.6 共聚焦显微镜303

15.7 染色体分析303

15.7.1 染色体显带技术306

15.7.2 染色体分析307

15.8 DNA含量308

15.8.1 DNA杂交308

15.8.2 DNA指纹技术308

15.8.3 DNA绘谱309

15.9 RNA和蛋白质314

15.10 酶活性314

15.10.1 同工酶314

15.10.2 利用Authentikit进行同工酶电泳315

15.11 抗原标记318

15.11.1 免疫染色320

15.11.2 免疫分析321

15.12 分化322

第16章 分化323

16.1 体内表型的表达323

16.1.1 去分化323

16.1.2 细胞谱系选择324

16.2 分化阶段324

16.3 增殖和分化324

16.4 定向和细胞谱系325

16.5 干细胞可塑性326

16.6 分化标记物327

16.7 诱导分化328

16.7.1 细胞相互作用328

16.7.2 全身性因子330

16.7.3 细胞-基质相互作用333

16.7.4 极性和细胞形状334

16.7.5 氧张力334

16.8 分化和恶性334

16.9 应用334

第17章 转化和永生化336

17.1 在细胞系鉴定中的作用337

17.2 什么是转化337

17.3 遗传不稳定性和异质性338

17.3.1 遗传不稳定性338

17.3.2 染色体畸变339

17.4 永生化339

17.4.1 衰老的控制340

17.4.2 病毒基因致永生化341

17.4.3 人成纤维细胞的永生化342

17.4.4 端粒酶诱导的永生化345

17.4.5 淋巴细胞永生化350

17.4.6 转基因鼠350

17.5 生长控制异常350

17.5.1 停泊不依赖性350

17.5.2 接触抑制351

17.5.3 血清依赖353

17.5.4 癌基因354

17.6 致瘤性354

17.6.1 恶性化354

17.6.2 肿瘤移植355

17.6.3 侵袭力355

17.6.4 血管发生356

17.6.5 纤溶酶原活化因子359

第18章 污染361

18.1 污染的来源361

18.1.1 操作者的技术363

18.1.2 环境364

18.1.3 层流通风橱的使用和维护364

18.1.4 湿度恒温箱364

18.1.5 冷藏库365

18.1.6 无菌材料366

18.1.7 引入的细胞系和活组织366

18.1.8 隔离366

18.2 微生物污染的种类366

18.3 污染物的监控366

18.3.1 可见的微生物污染367

18.3.2 支原体368

18.3.3 支原体的荧光染色369

18.3.4 PCR法检测支原体370

18.3.5 检测支原体的替代方法374

18.3.6 支原体检测服务375

18.3.7 病毒污染375

18.4 污染培养物的处理375

18.5 污染的去除376

18.5.1 细菌、真菌和酵母菌376

18.5.2 支原体的消除377

18.5.3 清除病毒污染378

18.5.4 顽固污染379

18.6 交叉污染379

18.7 结论380

第19章 冻存381

19.1 冻存的意义381

19.2 冻存前注意事项381

19.2.1 鉴定382

19.2.2 何时冻存382

19.3 冻存细则382

19.3.1 细胞冻存的理论背景382

19.3.2 细胞浓度382

19.3.3 冻存液383

19.3.4 冷却速度383

19.3.5 安瓿386

19.3.6 低温冰箱386

19.3.7 培养细胞的冻存389

19.3.8 冻存记录391

19.3.9 安瓿的解冻392

19.3.10 培养瓶冻存394

19.4 玻璃化保存394

19.4.1 hES细胞的冻存394

19.4.2 hES细胞解冻397

19.5 冻存库的设计和监控398

19.5.1 冻存管理399

19.5.2 细胞库存的连续更换399

19.6 细胞库400

19.7 细胞的运输400

19.7.1 冻存安瓿401

19.7.2 活细胞401

第20章 定量403

20.1 细胞计数403

20.1.1 血细胞计数器404

20.1.2 电子计数407

20.1.3 染色的单层细胞411

20.1.4 流式细胞仪411

20.2 细胞质量413

20.3 DNA含量413

20.4 蛋白质414

20.4.1 样品的溶解性414

20.4.2 Bradford分析414

20.5 合成速率415

20.5.1 DNA合成415

20.5.2 蛋白质合成417

20.6 准备样品用于酶分析和免疫分析418

20.7 细胞计数419

20.7.1 原位标记419

20.7.2 流式细胞术419

20.8 重复取样419

20.8.1 数据获得419

20.8.2 数据分析420

20.9 细胞增殖420

20.9.1 实验设计421

20.9.2 生长周期421

20.9.3 单层细胞生长曲线的分析425

20.9.4 培养基体积，细胞浓度和细胞密度427

20.9.5 悬浮培养428

20.9.6 生长周期的各个阶段429

20.9.7 生长曲线的衍生物430

20.10 贴壁效率431

20.10.1 集落形成分析433

20.10.2 自动集落计数434

20.11 标记指数434

20.11.1 生长分数437

20.11.2 有丝分裂指数438

20.11.3 分裂指数438

20.12 细胞周期时间438

20.13 细胞迁移438

第21章 细胞毒性439

21.1 活性、毒性和存活439

21.2 体外局限性440

21.2.1 药物代谢动力学440

21.2.2 新陈代谢440

21.2.3 组织和全身反应440

21.3 分析的性质440

21.3.1 生存力441

21.3.2 存活443

21.3.3 细胞增殖测定448

21.3.4 代谢性细胞毒性测定448

21.3.5 微滴定实验449

21.3.6 微滴定与克隆存活的比较453

21.3.7 药物的相互作用454

21.4 细胞毒性实验的应用454

21.4.1 抗癌药物筛选454

21.4.2 肿瘤药物的前瞻性实验454

21.4.3 药物学实验455

21.5 基因毒性455

21.5.1 姐妹染色单体交换的诱变实验455

21.5.2 致癌性458

21.6 炎症反应459

第22章 特殊类型细胞的培养461

22.1 特殊细胞培养技术463

22.2 上皮细胞463

22.2.1 表皮464

22.2.2 角膜469

22.2.3 乳腺471

22.2.4 子宫颈473

22.2.5 胃肠道476

22.2.6 肝478

22.2.7 原代肝细胞培养478

22.2.8 人肝癌细胞系HepaRG481

22.2.9 胰483

22.2.10 肾485

22.2.11 气管和支气管上皮487

22.2.12 口腔上皮489

22.2.13 前列腺490

22.3 间充质细胞492

22.3.1 结缔组织493

22.3.2 脂肪组织493

22.3.3 肌495

22.3.4 软骨501

22.3.5 骨504

22.3.6 内皮细胞506

22.4 神经外胚层细胞512

22.4.1 神经细胞512

22.4.2 神经胶质细胞513

22.4.3 内分泌细胞519

22.4.4 黑素细胞520

22.5 造血细胞523

22.6 生殖腺524

22.6.1 卵巢524

22.6.2 睾丸524

第23章 干细胞、生殖细胞和羊水细胞525

23.1 干细胞525

23.1.1 胚胎干细胞525

23.1.2 小鼠胚胎干细胞的诱导525

23.1.3 小鼠胚胎干细胞的传代培养和扩增530

23.1.4 人胚胎干细胞的原代培养532

23.1.5 hES细胞的传代534

23.1.6 鱼胚胎来源的多能干细胞535

23.2 生殖细胞539

23.3 胚外细胞540

23.3.1 羊水细胞的培养540

23.3.2 从新生儿或青年来源的细胞544

23.3.3 成人来源的多能干细胞544

23.3.4 人骨髓来源间充质干细胞545

23.3.5 诱导多潜能干细胞548

23.3.6 小鼠骨髓长期培养552

23.3.7 人原始造血细胞长期培养554

23.3.8 造血细胞集落形成分析559

第24章 肿瘤细胞培养562

24.1 肿瘤细胞培养中的问题562

24.2 取材563

24.2.1 代表性细胞的选择563

24.2.2 冷冻组织保存564

24.3 分离564

24.4 原代培养565

24.5 肿瘤细胞的选择培养566

24.5.1 选择培养基566

24.5.2 汇合饲养层566

24.5.3 悬浮克隆569

24.5.4 异种移植569

24.6 细胞系的建立570

24.6.1 原代肿瘤培养物的传代570

24.6.2 连续细胞系570

24.7 肿瘤细胞培养物的特征571

24.7.1 肿瘤细胞的异质性571

24.7.2 组织型培养572

24.8 特殊类型肿瘤572

24.8.1 乳腺572

24.8.2 肺574

24.8.3 胃575

24.8.4 结肠575

24.8.5 胰腺578

24.8.6 卵巢578

24.8.7 前列腺578

24.8.8 膀胱579

24.8.9 皮肤579

24.8.10 子宫颈580

24.8.11 胶质细胞瘤580

24.8.12 神经母细胞瘤581

24.8.13 精原细胞瘤581

24.8.14 淋巴瘤和白血病581

第25章 三维培养583

25.1 细胞的相互作用和表型表达583

25.1.1 细胞密度的作用583

25.1.2 相互作用584

25.1.3 模型的选择584

25.2 器官培养586

25.2.1 气体和营养物质的交换586

25.2.2 结构的完整性586

25.2.3 生长与分化587

25.2.4 器官培养的限制587

25.2.5 器官培养的类型587

25.3 组织型培养589

25.3.1 凝胶和海绵技术589

25.3.2 中空纤维590

25.3.3 球体590

25.3.4 转动室系统593

25.3.5 藻酸盐活细胞固定术594

25.3.6 滤膜培养皿594

25.3.7 神经聚集物的培养597

25.4 器官型培养599

25.4.1 组织等同物599

25.4.2 组织工程599

25.5 三维构建物中细胞的成像601

第26章 规模与自动化602

26.1 悬浮规模培养602

26.1.1 连续培养605

26.1.2 规模和复杂性606

26.1.3 搅匀和换气608

26.2 单层规模培养610

26.2.1 多表面扩增器610

26.2.2 旋转培养613

26.2.3 微载体615

26.2.4 巨型微载体617

26.2.5 灌流式单层培养619

26.3 程序控制620

26.4 自动化621

26.4.1 机器人细胞培养621

26.4.2 高产量检测622

第27章 特殊技术624

27.1 淋巴细胞的制备624

27.1.1 隔离的密度624

27.1.2 淋巴母细胞的转化625

27.2 放射自显影术626

27.3 间隔性记录632

27.4 细胞同步化634

27.4.1 细胞分离634

27.4.2 阻断635

27.5 冷血动物细胞的培养635

27.5.1 鱼细胞636

27.5.2 昆虫细胞636

27.6 体细胞融合637

27.6.1 细胞杂交637

27.6.2 移核实验640

27.7 单克隆抗体的制备640

第28章 培训纲要646

28.1 目的646

28.2 实验制备及操作技巧647

28.3 基本的细胞培养技术660

28.4 高阶练习682

28.5 特殊练习697

第29章 问题与对策698

29.1 细胞异常形态698

29.2 细胞生长缓慢699

29.2.1 仅限于自己细胞出了问题699

29.2.2 其他人也遇到同样的问题699

29.3 培养基700

29.3.1 试剂配方、准备和存储700

29.3.2 不稳定试剂701

29.3.3 配制培养基各种成分的纯度702

29.4 基质和容器703

29.5 微生物污染703

29.5.1 仅限于单个实验者的问题704

29.5.2 普遍问题705

29.5.3 室内供气和层流净化工作台706

29.5.4 特定污染706

29.6 化学污染707

29.6.1 玻璃器皿707

29.6.2 移液管707

29.6.3 水的纯化707

29.6.4 低温冻存707

29.6.5 粉末或气溶胶708

29.7 原代培养708

29.7.1 原代培养的存活率低708

29.7.2 选择细胞错误709

29.7.3 污染709

29.8 分化710

29.9 饲养层710

29.9.1 常规单层培养710

29.9.2 克隆培养710

29.10 传代711

29.10.1 收获率低或生长缓慢711

29.10.2 生长不均匀711

29.11 克隆712

29.11.1 培养皿形成的克隆数过低712

29.11.2 培养皿形成的克隆数太多713

29.11.3 非随机分布713

29.12 交叉污染和错误标记713

29.13 冻存714

29.13.1 复苏时存活率低714

29.13.2 冻存后细胞形态发生变化714

29.13.3 冻存细胞丢失715

29.14 细胞计数715

29.14.1 血细胞计数板715

29 14.2 使用电阻抗法电子计数仪715

第30章 结语717

附录Ⅰ 计算配制及试剂制备719

附录Ⅱ 设备及材料来源733

附录Ⅲ 供应商和其他资源763

附录Ⅳ 术语779

附录Ⅴ 交叉污染或鉴定有误的细胞系789

附录Ⅵ 一般教材与相关期刊809

参考文献811

索引883