抑制SMN2外显子7剪接的调控蛋白的鉴定和作用机制研究【2025|PDF下载-Epub版本|mobi电子书|kindle百度云盘下载】

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第1章 引言1

1.1 可变剪接调控的介绍1

1.1.1 前体RNA可变剪接1

1.1.2 剪接位点的识别和选择5

1.1.3 帮助剪接位点识别6

1.1.4 抑制剪接位点识别8

1.1.5 位置依赖性的剪接调控11

1.1.6 RNA结构在可变剪接调控中的作用12

1.1.7 蛋白因子调控可变剪接13

1.1.8 转录偶联的可变剪接调控15

1.1.9 可变剪接和组织特异性16

1.1.10 组成型剪接调控因子调控可变剪接19

1.1.11 可变剪接与人类疾病20

1.1.12 展望20

1.2 SMA和SMN的介绍22

1.2.1 SMA疾病的介绍22

1.2.2 SMA疾病相关的SMN2外显子7可变剪接的机制27

1.2.3 SMA的治疗方面的进展30

1.3 hnRNP U的介绍32

1.4 本课题的研究内容及意义33

1.4.1 课题研究的内容33

1.4.2 课题的研究意义33

第2章 材料和方法35

2.1 材料35

2.1.1 菌株、质粒及细胞系35

2.1.2 生化药品及来源35

2.1.3 细胞培养及操作相关的试剂36

2.1.4 酶类和DNA marker，蛋白marker36

2.1.5 抗体及其相关37

2.1.6 ssRNA和siRNA合成37

2.1.7 本研究所用引物38

2.1.8 分析软件和网络资源41

2.1.9 图像编辑软件42

2.1.10 仪器42

2.2 溶液的配制43

2.2.1 细菌用抗生素的配制43

2.2.2 蛋白纯化中所用的缓冲液43

2.2.3 DMEM细胞培养基的配制44

2.2.4 细胞专用PBS的制备44

2.2.5 细胞专用胰酶的配制44

2.2.6 免疫沉淀及免疫印迹相关溶液的配方44

2.3 方法45

2.3.1 E.coli RNaseⅢ的制备和纯化45

2.3.2 人类RNA结合蛋白esiRNA库的制备47

2.3.3 细胞培养和转染54

2.3.4 免疫印迹56

2.3.5 RT-PCR56

2.3.6 Trizol中提取蛋白58

2.3.7 突变克隆58

2.3.8 克隆的构建59

2.3.9 免疫共沉淀59

2.3.10 RIP-PCR60

2.3.11 免疫共定位60

2.3.12 CLIP-seq实验流程及注意事项61

2.3.13 RNA-seq72

第3章 结果与讨论74

3.1 RN Ai筛选发现HnRNP U是一个新的抑制SMN2可变外显子7剪接的剪接调控因子74

3.2 hnRNP U沉默同样会增强SMN1的剪接，暗示hnRNP U不是通过靶向外显子7的C到T变化所产生的ESS而起作用的77

3.3 hnRNP U抑制SMN2的剪接不依赖于任何已知的ISS79

3.4 hnRNP U可能不是通过影响转录延伸来抑制SMN外显子7的剪接的80

3.5 hnRNP U在体外不与SMN2外显子7及附近的内含子RNA结合，而在细胞内结合SMN2转录本82

3.6 大规模筛选人类RNA结合蛋白发现了另外8个新的抑制SMN2外显子7剪接的蛋白质，其中5个是与U2 snRNP相互作用的蛋白83

3.7 hnRNP U与U2AF65/35通过RNA依赖的方式相互结合，并协同调控SMN2外显子7的剪接86

3.8 CLIP鉴定hnRNP U结合的RNA靶标87

3.9 hnRNP U结合U2 snRNA，证明它是U2 snRNP的一个重要组分89

第4章 研究工作总结和展望92

4.1 工作总结92

4.2 展望93

参考文献96

缩写索引113

致谢115